Novel molecular mechanisms in chronic intestinal pseudo-obstruction

Abstract:

Le neuropatie enteriche sono condizioni gastrointestinali severe caratterizzate dalla grave compromissione della fisiologia intestinale, inclusa la motilità. Il fenotipo clinico più comunemente correlato alla neuropatia enterica è la pseudo-ostruzione intestinale cronica (CIPO), un grave disturbo della dismotilità che si manifesta con episodi sub-ostruttivi intestinali ricorrenti, in assenza di cause meccaniche di occlusione. Negli ultimi anni sono state identificate diverse cause genetiche della CIPO. La scoperta di nuovi geni è di fondamentale importanza per una migliore comprensione delle neuropatie enteriche e della grave dismotilità intestinale correlata. Si prevede che questi studi sviluppino nuovi bersagli terapeutici per i pazienti affetti, il cui trattamento e miglioramento della qualità della vita si presenta complessa quadro clinico estremamente eterogeneo e di difficile interpretazione. Il nostro gruppo ha identificato una nuova mutazione omozigote in una forma recessiva di CIPO, la variante missenso dannosa p.Ala622Thr in RAD21. RAD21 regola diversi meccanismi cellulari come parte della coesina, un complesso multiproteico cruciale per il ripiegamento della cromatina e la regolazione trascrizionale. Il silenziamento funzionale di Rad21 nel modello zebrafish causa una grave compromissione della motilità intestinale, con una significativa deplezione di neuroni enterici, che ricorda il fenotipo CIPO osservato nei pazienti con la mutazione RAD21. Per studiare come la mutazione RAD21 influisce sulla funzionalità del sistema nervoso enterico (SNE), abbiamo sviluppato un topo knock-in condizionale Rad21 portatore della mutazione p.Ala626Thr (posizione omologa alla p.Ala622Thr riscontrata nei pazienti). Si prevede che questo modello riproduca le principali caratteristiche cliniche e patologiche osservate nei pazienti. I risultati preliminari hanno mostrato che i neuroni mienterici colinergici sono significativamente ridotti nei topi Rad21A626T rispetto ai topi wild type (WT) di controllo. Questi dati preliminari forniscono una base per indagare ulteriormente l'intero spettro di anomalie nel modello di topo, come paradigma della CIPO negli esseri umani. Pertanto, gli obiettivi principali di questo progetto sono: (1) ricapitolare la compromissione funzionale causata dalla mutazione missenso RAD21 nei pazienti, attraverso la caratterizzazione del modello di topo Rad21A626T; (2) identificare la disregolazione dipendente da RAD21 dei geni bersaglio nel sistema gastrointestinale del topo e correlarli al fenotipo CIPO. A nostra conoscenza, questo è attualmente l'unico modello disponibile per la CIPO e rappresenterà quindi uno strumento prezioso per ulteriori indagini su un disturbo ancora orfano, al fine di progettare terapie ad hoc. Il nostro studio fornirà una nuova analisi approfondita del fenotipo intestinale dovuto al mutante Rad21 e caratterizzerà non solo i neuroni enterici interessati dalla mutazione RAD21, ma anche i geni bersaglio regolati da RAD21 nello SNE. Questi dati miglioreranno la conoscenza dei deficit molecolari e fisiologici del CIPO e aiuteranno a sviluppare interventi terapeutici ad hoc.

Risultati attesi: 

Abbiamo quindi caratterizzato istologicamente e funzionalmente il nuovo modello murino. Nel topo Rad21KI^A626T non abbiamo osservato un'alterazione significativa nel numero totale complessivo di neuroni enterici HuC/D, ma abbiamo riscontrato un aumento significativo dei neuroni mienterici ChAT-positivi (neuroni immunoreattivi sia per ChAT che per HuC/D) nel colon, rispetto ai topi Rad21^wt di controllo. Al contrario, non abbiamo osservato differenze nel numero di neuroni HuC/D/nNOS positivi, un dato questo che suggerisce una selettività dell'effetto della mutazione RAD21 nel SNE. Queste differenze tra neuroni colinergici e nitrergici aprono nuove prospettive sulla funzione di RAD21 nell’innervazione enterica. È possibile ipotizzare una funzione trascrizionale alterata mediata da RAD21, considerando che RAD21 regola diversi meccanismi cellulari nel ripiegamento della cromatina e nella regolazione trascrizionale come parte del complesso della coesina. In particolare, in D. Melanogaster l'inattivazione di Rad21 nei neuroni postmitotici è risultata letale: nei neuroni dei corpi fungiformi, ha portato a difetti nel pruning degli assoni, mentre nei neuroni colinergici causa un effetto drammatico sulla locomozione larvale, generando movimenti e traiettorie scoordinati, rispetto agli animali in cui Rad21 era normalmente espresso. L'alterazione specifica di Rad21KI^A626T della trasmissione eccitatoria nel colon suggerisce che questo sottoinsieme di neuroni enterici può contribuire alla compromissione della motilità intestinale nei pazienti con CIPO da mutazione RAD21. I nostri dati su un topo geneticamente modificato riflettono quanto osservato anche in studi sulla colite indotta farmacologicamente, che solitamente rilevavano stitichezza e/o ridotta motilità gastrointestinale negli animali trattati. Infatti, un recente studio sulla colite indotta da destran-solfato sodico (DSS) ha riportato che, oltre al ritardo della motilità gastrointestinale, i topi trattati con DSS mostrano una maggiore immunoreattività per i neuroni mienterici ChAT, rispetto ai topi sham trattati (di controllo).

Sulla base di questi risultati strutturali e molecolari, abbiamo valutato la funzione della motilità gastrointestinale dei topi Rad21KI^A626T misurando il tempo totale di transito gastrointestinale tramite l’eliminazione delle pellet fecali. Il significativo aumento del tempo di transito intestinale osservato nei topi Rad21KI^A626T rispetto ai topi Rad21^wt è coerente con il fenotipo CIPO. Per indagare ulteriormente l'attività di transito intestinale ritardata, abbiamo eseguito un'analisi ex vivo della motilità miogenica e nervosa del colon nei topi Rad21KI^A626T e Rad21^wt, che ha mostrato un aumento significativo della motilità stimolata da potenziale elettrico (electric field stimulation, EFS).

Il nostro modello fornisce prove di una disregolazione selettiva dell'espressione colinergica nell'intestino crasso che probabilmente contribuisce alle alterazioni del transito intestinale e della motilità del colon. Ulteriori studi forniranno informazioni sul ruolo di Rad21 nello stabilire/regolare la connettività colinergica nello SNE. In particolare, nell’ultimo periodo del progetto ci focalizzeremo sull’analisi della trascrizione: (1) via RNAseq nel colon dei topi mutati vs. wild-type, per identificare i geni target disregolati e studieremo tramite (2) HiC the regioni regolatorie cromatiniche alterate dalla presenza della mutazione in RAD21. Questi dati miglioreranno la conoscenza dei deficit molecolari e fisiologici del CIPO e aiuteranno a sviluppare interventi terapeutici ad hoc.